细菌分离培养是兔场实验室诊断工作中一个十分重要的步骤,通过对细菌的分离和纯培养,可以根据菌落的形态、大小、结构、色泽、气味以及有无溶血等情况进行初步鉴定,然后通过进一步的染色镜检或者是特殊培养进行鉴定或研究,为病原的确诊提供依据。
1.培养基制备培养基是细菌学检查过程中非常重要的材料,它含有细菌生长所必需的营养物质,细菌经过培养基的纯培养,才能够进行准确的检查,得到可靠的结果。
(1)肉水的制作:
①材料:瘦牛肉500克,蒸馏水(或常水)1000毫升。
②方法:取瘦牛肉除去脂肪、肌腱,切成碎块或绞碎,按1千克牛肉2千毫升水的比例,加水浸泡一夜,煮沸一小时,用纱布初步滤去肉渣挤出肉水,再用滤纸滤过,补足原有水量,装入烧瓶中置高压灭菌器中120℃20分钟灭菌,制成肉水。
制作肉水的另一种方法是:取牛肉浸膏0.5-1.0克,加蒸馏水100毫升,加热溶解,滤纸滤过,并同上述方法进行灭菌即成。
③用途:制作各种培养基的基础。
(2)营养肉汤:
①材料:肉水1000毫升,蛋白胨IO克,氯化钠5克。
②方法:将蛋白胨和氯化钠加入肉水中,稍加热溶解,用氢氧化钠溶液调整pH值为7.4-7.6之间,再加温使溶液均匀。滤过分装后高压灭菌备用。
③用途:可供一般的细菌生长需要,检查细菌的生长表现,也可作为制作固体培养基的基础。
(3)营养琼脂:
①材料:营养琼脂粉40克,蒸馏水1000毫升。
②方法:将营养琼脂粉加入蒸馏水中,搅拌浸泡1小时,加热使充分溶解,高压灭菌备用。
③用途:分离细菌纯培养及作为其他特种培养基的基础。
(4)血液琼脂培养基:
①材料:脱纤维血5-10毫升,营养琼脂100毫升。
②方法:准备好灭菌并有玻璃珠的三角烧瓶,无菌采集血液,注入三角烧瓶中,不停地摇动,直至血纤维分离为止,一般需要10分钟。
高压灭菌好的营养琼脂融化后,冷却至55-60℃时加人脱纤维血液,注意必须确保无菌操作,加入血液后轻轻摇动,不使产生气泡,立即倒人无菌平皿或分装于灭菌试管中备用。
③用途:观察细菌的溶血情况,有些细菌的初次分离时需要此种培养基。
(5)厌氧肝片肉汤:
①材料:营养肉汤,动物肝块或肉渣,液体石蜡。
②方法:利用作肉汤的碎肉块、肉渣或者是动物肝脏少许,分装于试管中加营养肉汤5毫升,上层加液体石蜡0.5-1.0毫升.120℃20分钟灭菌备用。
③用途:厌氧菌的培养。
(6)麦康凯琼脂:
①材料:麦康凯琼脂粉38克,蒸馏水1000毫升。
②方法:将麦康凯琼脂粉加入蒸馏水中,搅拌浸泡l小时,加热使充分溶解,高压灭菌备用。
③用途:常用作大肠杆菌类细菌的分离培养。
2.细菌接种方法
(1)平板划线接种法:平板划线接种法是细菌分离培养中最常用的方法,能使细菌分散生长,形成单个菌落。左手持培养皿,用拇指、食指及中指将平皿揭开,角度不要超过20度,右手拿接种环,接种环与琼脂表面约呈45度角。取少许病料涂布于培养基边缘,火焰灭菌接种环,冷却后轻触培养基边缘的病料区,并向一边划出横线,可以连续划出一个小区,火焰灭菌接种环,冷却后将平皿转换角度,从第一个小区再向外划出一个小区,以后再按照同样方法分区将平板划满,注意只能在起始部位与前一个小区交叉。
(2)琼脂斜面接种法:本方法多用于菌种的保存,也可以用于细菌的分离。左手持斜面培养基,右手持接种环,火焰灭菌冷却后挑取所需的菌落,以右手小拇指夹住棉塞或胶塞,轻转后取出,注意不要污染,立即将管口和塞子火焰灭菌,将接种环伸入试管内,自斜面底部向管口方向划曲线,再经火焰消毒管口和塞子后盖严,进行培养。
(3)穿刺接种法:本法适用于半固体、固体培养基以及微量发酵管的接种,用来做细菌的生化和动力学实验。沿培养管中心直刺至距管底约0.5厘米处,然后再沿穿刺线退出接种针。
(4)液体培养基接种法:方法基本同斜面接种法,将接种环在培养管壁的液面下摩擦,然后再在液体中振动几次,塞好塞子。注意塞子和管口的灭菌操作。
3.细菌培养方法
细菌的培养方法根据细菌的生长特性、培养目的、要求等不同而不同。主要分为以下几种:
(1)需氧培养法:即一般培养法。细菌接种培养基后,置于37℃培养箱内培养即可。适用于需氧菌及兼性厌氧菌的分离培养。
(2)二氧化碳培养法:某些细菌要在一定的二氧化碳环境中才能良好生长。
①烛缸法:将接种的培养基置于干燥器内,点燃蜡烛后,密封好,连同容器一起置温箱中培养。
②化学法:每升容器中按照碳酸氢钠0.4克,盐酸3.5毫升的比例,分别装入两个小容器中,置于干燥器中,密封后使两药接触产生二氧化碳。
③二氧化碳培养箱法:将培养基置于特制的二氧化碳培养箱中培养,可以根据需要调节二氧化碳的浓度。
(3)厌氧培养法:
①换气法:将培养基放入干燥器内,将干燥器内抽成真空,然后充入氮气、氢气和二氧化碳的混合气体,放人温箱中培养。
②焦性没食子酸法:焦性没食子酸在碱性溶液中形成焦性没食子酸盐,可以吸收空气中的氧气,从而造成无氧的环境,适合厌氧菌生长。培养方法:将平皿去盖翻转,放置焦性没食子酸1克,再覆上一层脱脂棉,在脱脂棉上滴加IO%的氢氧化钠1毫升,然后将接种好的平皿覆盖在翻转的盖上,迅速用蜡封固,置37℃温箱中培养2-4天,观察结果。接种的培养基如果是试管,可取大试管一支,底部放焦性没食子酸2克,并加玻璃珠10多粒,将培养基试管放在玻璃珠上,再沿大试管壁滴加10%氢氧化钠溶液2毫升,将大试管口用橡皮塞塞紧,置37℃温箱中培养。
③厌氧肝片肉汤接种:因肝片或肉渣内含有谷胱甘肽,可发生氧化反应而降低环境中的氧化势能,以利于厌氧菌的分离。接种方法是用接种环钩取病料,接种于培养基中,在37℃温箱中培养2-4天,观察结果。
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